病毒检测变异是病毒清除研究变异的主要来源:对大量数据集的回顾性分析

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从哺乳动物细胞培养物中生产的生物制药容易受到病毒污染。这种风险通过应用补充方法得以缓解。这些方法包括广泛测试细胞库、选择低风险原材料、测试病毒培养,以及记录纯化过程灭活和清除病毒的能力ove病毒污染物。后者通常被称为病毒清除通常表示为对数折减值(LRV)。

图1:滴度(左)和对数(右)值的分布;我们对阳性对照材料进行了139次滴度测定。范围(从最低到最高的值)被分成8个大小相等的区间(1–8),并对每个间隔内的数据点数量进行计数,并显示在直方图中。对于正态分布,期望围绕平均值的对称分布。

诺和诺德针对不同的工艺和步骤进行了几项病毒清除研究。这一庞大数据集的可用性使我们能够进行全面的统计分析。下面,我们将小鼠微小病毒(MVM)作为模型病毒,展示病毒清除研究的数据。我们按照目前的指导方针进行了10多年的研究(1、2).

一些法规提供了如何进行病毒清除验证的指南,包括使用哪种模型病毒以及如何计算LRV因子。这方面的关键指导文件是ICH Q5A(R1)(1.).它提供了丰富的信息和要点,以考虑如何最好地处理病毒清除的研究。该指南指出,“病毒清除研究应包括使用数据的统计分析来评估结果。研究结果应该在统计上有效,以支持得出的结论。”

尽管ICH Q5A(R1)说明了病毒定量分析的精确程度,但它并未提供如何进行LRV所需统计分析的指导。因此,生物制药制造商对该问题的解释有所不同。
病毒清除率的研究采用单个单元操作的缩小版本,如色谱步骤。缩小系统必须代表更大的制造规模过程,以提供适用的数据。一旦建立了有效的缩小模型,生物制造商在运行过程中故意添加工艺材料th病毒。

病毒的浓度(滴度)在加标的工艺材料和最终产品部分中测量。根据效价T和体积五、,LRV按照“方程式”框中的方程式1计算。在此,我们分析了大量滴度和LRV测定数据集,以了解病毒定量的变化及其对单个步骤和总体(累积)LRV的LRV变化的贡献。

病毒定量分析的方差分析
ICH Q5A(R1)规定了用于确定LRV的分析的以下要求:“分析内变化结果的95%置信限通常应为±0.5 log10因此,应计算对数(滴度)的变化。对数正态分布的证明将影响滴度和LRV数据的统计评估。滴度测定的变化必须在使用标准化方法的分析验证期间解决(1, 3).尽管对数(滴度)通常被假定为正态分布,但在验证活动中很少涉及该假设。因此,我们仔细评估了该假设。

六年多来,诺和诺德公司一直使用单一库存的MVM作为所有MVM检测的阳性对照。病毒以等分的形式储存在温度低于-70°C的无血清培养基中。需要使用时,将等分的MVM解冻以进行分析,并丢弃剩余量以防止病毒丢失在重复冻融循环中。使用的试验是标准限制稀释试验:将连续10倍稀释的供试品接种在允许细胞上(每稀释8孔),在37°C下培养,读数基于细胞病变效应。滴度确定为组织培养感染剂量中值(TCID)50)使用Spearman–Kärber方法并表示为TCID50/在六年期间,我们对储备溶液进行了139次测定(附录a,在参考和确认后列出)。

数据表明病毒完全稳定。这139个复制值用于确定获得的最小值、平均值和最大值。我们还计算了标准偏差(σ),并将其与表1中列出的平均值进行比较。我们计算了滴度的绝对值和对数值(滴度)表1列出了数值和对数转换滴度值的数据汇总。滴度和对数(滴度)的平均值的σ百分比非常不同。对于任何测量系统,82%的相对σ都是一个极值。但通常可以看到5%的值。

然后,我们描述了每个数据集中数据的分布。最初,我们使用了一种简单的“组和图”方法。每组数据(滴度或对数(滴度))的范围(最小到最大)被划分为八个大小相等的区间。确定了每个区间内的数据点数量,并用于绘制图1中的直方图。这些剖面图表明,数值并非均匀分布在平均值周围。对数(滴度)值呈钟形分布,高度对称。这种类型的图表提供了滴度变化的第一个说明,很容易理解。

图2显示了正态分位数图中的相同数据集,用于可视化变量正态分布的程度。如果变量是正态分布的,则正态分位数图近似于一条对角线。对数(滴度)显示出良好的正态分布相关性。然而,滴度图显示出明显偏离正态分布。在此基础上,我们认为log(滴度)为正态分布。因此,ICH Q5A(R1)中规定的对数精度(滴度)要求似乎完全合理。

图2: 滴度(左)和对数(滴度)(右)的正常分位数图;总共进行了139次血清阳性对照物质效价测定,并检查所得值是否符合正态分布。对数(滴度)显示出良好的正态分布相关性(右),但滴度显示出明显偏离正态分布(左)。

LRV重复测定大数据集的方差分析
使用的数据集:十多年来,我们使用上述MVM分析法进行了几项病毒清除研究。我们研究了不同的过程步骤:对于该分析,我们首先选择了包含重复测定的研究。其次,我们删除了没有病毒恢复的研究。这是因为这些情况下的LRV不会反映实际的病毒清除率通过过程步骤获得批准,但估计的“最小值”与下面描述的统计分析无关。我们的方法导致总共57项研究纳入分析(附录B,在参考和确认后列出)。

对于这57项研究,单个测定(例如,对于给定的纯化步骤)之间观察到的差异计算为ΔLRV。该差异反映了该特定工艺步骤的组合变化(例如,通过滴度测定、工艺步骤执行和其他因素引入的变化).方程式2显示了根据方程式1改写的LRV计算。

如果我们假设体积变化可以忽略不计,那么滴度测定对变化的贡献来自对数10(T之前)和日志10(T之后).因为检测T之前T之后是相同的,σ的值是相同的。所以,σlog(T之前)=σlog(T之后)=σ。基于此,假设σlog(T之前)和σlog(T之后)相互独立,分析对LRV变化的贡献可写成方程3。因此,分析对σLRV的贡献约为1.4σlog(T)这意味着,如果重复滴定来自同一研究的样品,则在LRV中观察到的变化预计为1.4×σlog(T).

现在考虑两个单独的病毒清除验证研究的特定纯化步骤,每一个分别确定LRV(LRV1和LRV2)。这两个测定值(ΔLRV)之间的差异将来自分析和工艺步骤的变化。最初,我们可以假设两个实验中病毒去除完全相同的情况。在这种情况下,对变异的唯一贡献来自分析。等式4显示了如何使用前面的等式计算贡献。因此,可以预测分析方差对ΔLRV方差的影响。这些计算仅涉及滴度测定的影响。

在某些情况下,两个实验会有不同的病毒减少值。因此,方差将高于上述计算的预期。从病毒安全的角度来看,病毒减少的变异是重要的。真正的挑战是在来自病毒试验的变异背景下确定变异。
所有研究中使用的MVM分析已经过验证,并且满足LRV研究中使用的精度要求(1, 3).在验证期间,我们确定了σlog(T)为0.21(数据未显示)。利用式4,σ(ΔLRV)的贡献为0.42。

图3: ΔLRV(数值)作为LRV函数的曲线图;大部分数据点在大约0.4左右均匀分布。四个数据点与此明显不同。

真实数据(重复运行)告诉我们:在我们的57项研究中,观察到的变异为0.62。这个值比单从滴定度测定的预期值要高。考虑到滴度测定只是导致变异的几个因素之一,这个较高的值并不令人惊讶。然而,我们发现有趣的是,预期和观察到的差异不大于0.20。这表明,病毒滴定的变异确实是LRV总体变异的主要原因。

我们推测变异(以ΔLRV表示)是否取决于LRV的大小(例如,有效病毒清除步骤的更高变异)。图3显示了ΔLRV随LRV变化的曲线图。如果ΔLRV取决于LRV,则曲线图将增加(数据点将沿着曲线图中的对角线)。然而,情况并非如此。
病毒检测也可能是变异的主要来源——这并不奇怪。一些研究显示ΔLRV大于正常值。图3中的数据集显示,四个实验中ΔLRV显著大于一个。表2列出了这四个实验。

为了更好地理解我们的结果,我们评估了这四个实验。在这两项阴离子交换研究中,病毒和蛋白质都与柱结合。结合蛋白通过梯度洗脱释放出来。使用聚合酶链反应(PCR)进一步分析表明,病毒在感兴趣的蛋白后立即被洗脱。这表明病毒和蛋白质的结合特性是相似的。因此,即使尾缘切割的微小变化也会显著影响进入峰值部分的病毒数量。在这种情况下,流程步骤执行中的微小变化可以预期转化为LRV变化。

实验209003a是一项使用20 nm过滤器的病毒过滤研究。它包含一系列六个重复的前两个值(接下来的四个在209003b和209003c)。碰巧,所有六个值中的最低值和最高值首先出现,因此在209003a中分组。如果计算所有六个值的σ,则σ(LRV)值为0.80。该值大大高于预期值2×0.21。因此,该特定纳滤步骤的输出变化确实明显大于单独滴定的预期值。因此,这些研究(209003a、-b和-c)在病毒去除方面存在真正的差异。当时(2009年),这种高变异的原因尚不清楚。

实验216124也是使用相同类型的20nm过滤器进行病毒过滤的研究。后续实验证实,变异比仅根据测定变异预测的要大。调查研究显示,这个特定步骤的值从2.1到6 log或更多(数据未显示)。这些结果与过滤器制造商进行了讨论,并确定过滤器上的高病毒载量是一个可能的原因。降低病毒载量会立即产生更多可复制的LRV,证实了病毒载量是这个纳滤步骤重现性的一个重要因素。这一效应也可能解释在209003a实验中观察到的大变异,因为该实验也是在高病毒载量下进行的。209003a实验是在2009年进行的——在我们确定病毒载量是在病毒过滤中观察到的LRV的一个关键因素之前。由于项目在此期间关闭,研究209003没有被重新访问。因此,实验209003a的潜在原因尚未得到正式验证。

值得注意的是,高病毒载量是病毒清除研究期间引入的伪影,并不代表真实情况。因此,我们在上述实验中观察到的再现性差是由于实验条件,并不反映工艺步骤的再现性问题统计分析中省略了可重复性实验,然后观察到的σΔLRV为0.43(基于剩余的51个数据点),这几乎与单独病毒分析的预期值相同。因此,对于稳健步骤(不容易因流程执行而发生变化),观察到的变化(重复之间的差异)与分析变化的预期值相对应。

经验教训
从观察到的LRV的即时统计分析中得出的经验教训可总结如下:

  • LRV的增加似乎不会导致LRV的较大变化。
  • 对于稳健的步骤,可以通过滴度测定的变化预测LRV的变化。

对于具有极高ΔLRV的四项研究,我们确定了可能的原因。在一个案例中,相关蛋白质和MVM的洗脱条件相似,导致从工艺步骤到总体LRV变化的显著贡献。在另一个案例中,病毒过滤器过载导致不良且不可复制的病毒滞留现实生活中的病毒过滤器不会遇到如此高浓度的病毒。

相反,这种过滤器应该将无法检测到的病毒数量减少到更低的水平。
如果可以消除导致如此高变异的条件,那么LRV测定中的变异(在实际应用中)仅与滴度测定中的变异有关。即使病毒减少没有变异,LRV也会在重复之间发生变化。将此类差异解释为工艺步骤变异将是不可能的从统计学上讲。

仍然存在的挑战是如何在病毒分析本身产生的LRV变异的背景下检测病毒减少的微小变化。可以说,每个病毒清除研究都应重复足够的次数,以获得该特定过程步骤LRVσ的可靠估计。这可能需要多次重复从实际和经济的角度来看,这种方法是不可行的。
我们的数据集仅包含以MVM作为模型病毒进行的研究。对另一种常用的模型病毒进行了类似的分析,包括小鼠白血病病毒(MuLV)。一般结论是相同的,但由于可供分析的研究(LRV一式两份,且病毒回收)明显较少,因此该结论对该病毒的证据不足(数据未显示)。然而,它确实符合观察结果,即如果一个步骤是稳健的,那么LRV变异由病毒测定中的变异决定。

累积LRV方差的影响
单个步骤的LRV变化可靠估计的可用性能够估计变化(因此置信区间)对于整个纯化过程的累积病毒清除率。如果已知各个步骤的变化,则累积病毒清除率的σ可如等式5所示计算,其中N是导致累积间隙的步数。该计算是在假设单个步数的变化是独立的情况下进行的。

该方程适用于LRV的单次测定。如果重复值的平均值用于累积LRV,则σ(LRV复制)可通过使用方程式6计算得出累积值的方程式7。如果进行了多个重复测定,则可相应修改这些计算。

虽然我们的结果补充了McAllister等人和Ruppach之前发表的数据(4, 5),方法是不同的。我们应用先验的分析精度知识来预测分析精度对LRV结果的影响。这使得流程方差的视图更加清晰。我们的方法还排除了所有没有病毒被恢复的数据点(例如,我们的数据点没有“大于”值)。这消除了病毒峰值水平变化所产生的实验噪声。最后,基于大量研究的分析(N=57),通过重复测定LRV,我们能够将工艺步骤分为预期(分析驱动)变化范围内的步骤和其他显示更多的步骤。

分析变异是关键
我们对病毒滴度和病毒清除率研究的数据分析对导致LRV测定变化的机制提供了有价值的见解。对数(滴度)值呈正态分布,这使我们能够预测滴度测定对LRV的影响。

如果一个处理步骤是稳健的(不容易因处理执行而发生变化),我们得出结论,病毒清除研究中的主要差异来源实际上是用于病毒定量的分析。根据我们的结果,可以对净化过程的累积清除率作出95%置信区间的合理估计。这种估计可以为ICH Q5A(R1)所要求的统计分析奠定基础。

重复品之间的巨大差异可能表明给定纯化步骤的稳健性较差。在这种情况下,估计实际变化并不容易。解决这种情况的一种实用而简单的方法是使用观察到的最低值计算累积LRV,并根据分析变化估计σ。尽管从统计学的角度来看,这种方法当然不是无可指责的,当可用信息有限时,它可能是一种合理的做法。

基于这些考虑,我们建议采用以下方法记录病毒清除情况:

  • 重复测定LRV。
  • 对于ΔLRV在基于σlog的预期范围内的研究(T),报告平均LRV值。
  • 对于ΔLRV大于基于σlog的预期值的研究(T),报告了最低LRV值。
  • 根据上述第二点和第三点所述LRV值的总和计算累积间隙。
  • 基于步骤数和σlog(T),计算累积清除的置信区间。

上述方法可根据ICH Q5A(R1)指南的要求,在报告生物制药生产过程中的病毒清除结果时提供适当的统计支持。

致谢
作者感谢诺和诺德A/S公司3680 CMC过程和培训支持部Peter Thyregod在编写本手稿期间提供的统计帮助。

工具书类
1.ICH Q5A(R1):ICH协调三方指南-来源于人类或动物细胞系的生物技术产品的病毒安全性评估,步骤5. 国际人用药品技术要求协调理事会:瑞士日内瓦,1997年。

2.CPMP BWP / 268/95:病毒验证研究指南注释:验证病毒失活和去除的研究的设计、贡献和解释.欧洲药品评估机构:荷兰阿姆斯特丹,1996年2月。

3.ICH Q2(R1):ICH协调三方指南-分析程序验证:文本和方法,步骤4.国际人用药品技术要求协调理事会:2005年11月,瑞士日内瓦。

4.McAllister PR,等。使用统计策略评估重组生物制药的病毒安全性实验中的变异来源。戴夫·比奥。站88年,1996年;111 - 121。

5.Ruppach H.原木10病毒清除研究中的减少因子。生物过程。J。12(4) 2014: 24–30;http://dx.doi.org/10.12665/J124.Ruppach.

附录

坎斯特鲁普是诺和诺德A/S公司2299生物制药原料药制造开发部的首席科学家,地址:丹麦金托夫特DK-2820 Nybrovej 80;45-3075-8598;SKAM@novonordisk.com.汤姆森是诺和诺德公司609病毒学系的开发科学家。

作者声明他们没有相互竞争的利益。

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