在下游AAV过程中的病毒间隙:使用模型病毒面板和非排感替代的案例研究

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腺相关病毒8血清型(上)与小鼠微小病毒(下)结构相似。
图片来源:蛋白质数据库https://www.rcsb.org.的)

在过去十年中,腺相关病毒(AAV)载体已成为主要的基因传递载体。2017年,基因治疗的管道包括351种临床试验药物和316种临床前开发药物(1 - 4)。由于这些候选人提前来说,在过程开发和制造中正在进行重大努力,用于减少过程杂质的总体目标,同时保持最高的过程产量。

为了实现这一目标,行业供应商开发了创新的AAV特异性分离技术。Thermo Fisher Scientific的POROS CaptureSelect AAVX亲和树脂为多种天然和合成AAV血清型提供了一种捕获方法,而不考虑用于产生它们的表达系统。通过利用专有重组nt camelid抗体技术固定在高渗透性的POROS骨架上,该树脂实现了对AAV识别的微调特异性,增加了AAV结合的表面积和容量。该亲和树脂的显著杂质减少优势和快速可扩展性已导致其并入数个著名的AV下游工艺设计。

BIA分离(现在是Sartorius AG的一部分)已开发并商业化CIMmultus QA整体,该整体已在多个AAV下游工艺中被引用,因为其能够有效分离空的和满的病毒颗粒。整体支架代表了液相色谱、生物转化和固相合成的独特固定相类型。除了增加过程由于速度快,整体流通孔(通道)也为大分子提供了方便,从而支持质粒DNA(pDNA)分子和AAV颗粒等纳米颗粒的纯化和去除。

AAV过程开发的一个难以捉摸的方面是病毒清除。如ICH Q5A指南所示,病毒清除验证是管理所有重组生物药物的关键监管要求(5.)。根据这些指导方针,病毒污染的风险应通过三管齐下的方法进行努力:预防,试验和删除。在过去的几十年中,单克隆抗体(MAb)的某些病毒清除策略,例如低pH灭活和纳米过滤,已成为大多数下游过程的标准。但是,因为AAV是病毒本身(在家庭内Parvoviridae.),可能不可能将在单抗工艺中效果很好的纯化策略应用于它们。因此,基因治疗行业可能越来越依赖色谱分离模式来证明足够的病毒清除。

在本文报道的研究中,我们通过进行缩小模型峰值研究和使用临床相关AAV8下游纯化工艺测量病毒清除来解决病毒清除问题。两步色谱过程首先使用POROS CaptureSelect AAVX亲和树脂进行亲和捕获,然后使用CIMmultus QA整体块进行阴离子交换抛光。

我们选择了尖刺剂,各种病毒具有不同尺寸,分子化妆和物理化学性质。对于DNA病毒,我们使用的封装伪论病毒(PRV)和非共发育的小鼠(MVM)。对于RNA病毒,我们使用包膜异鼠白血病病毒相关病毒(Xmulv)和非共度的reovirus型3(REO-3)。我们还包括人体传染肝炎A(HAV)和单纯疱疹病毒1(HSV-1),基于可能的偶然病毒污染的风险评估,其具有用于上游生产的HEK293人衍生的生产者细胞系。

为了未来工艺开发者的利益,他们可能希望在自己的纯化工艺步骤上进行类似的病毒清除试验,但缺乏进行此类资源密集型研究的能力,我们评估了Cygnus Technologies,LLC提供的MockV MVM工具包,作为生成预测性MVM清除数据的一种经济、快速的方法(6.).在整个研究过程中,我们将该试剂盒与MVM加标试验同时使用。

材料
用于这些病毒清除研究的所有AAV均由REGENXBIO Inc.的平台工艺以代表性规模生产。

病毒和模拟病毒颗粒(MVP)的生产:根据标准方案,病毒由马里兰州弗雷德里克的Texcell NA进行繁殖和纯化。在杆状病毒表达载体系统(BEVS)中表达主要MVM衣壳蛋白(VP2)后,使用甜菜夜蛾9(科幻小说9) 天鹅座科技公司的细胞。用亲和和离子交换色谱法(IEC)对颗粒进行纯化。透射电子显微镜(TEM)用于验证MVP的形态、大小和浓度。

色谱产品:Thermo Fisher Scientific提供预包装、5-mL POROS CaptureSelect AAVX亲和树脂柱;BIA分离提供直径为4-mL和8-mL的缩小CIMmultus QA整体柱装置。对照POROS树脂由Thermo Fisher Scientific定制,具有与所用亲和树脂相同的基珠,但包含替代物虚拟现实HH配体特异性(非绕过AAV)或NO V.HH官能化配体。

方法
学习规划:评估REGENXBIO下游工艺中亲和树脂和整体抛光步骤的稳健性(7.),我们选择了“中心点”和“最坏情况”处理参数进行病毒清除峰值实验(表1)。对于每次运行,我们在过程中的AAV材料中添加模型病毒或MVM MVP,目标为10.0 log10.MVM-MVP / mL并相应加工。

对于亲和树脂中心点和替代配体运行,我们根据标准制造负载率和停留时间加载150 mL加标材料。对于最坏情况,我们加载200 mL加标材料(目标的133%)降低流速,将停留时间延长至中心点目标的170%。在整体抛光研究中,我们在最坏情况下(MVP和XMuLV加标运行除外)将中心点加载体积分别为90 mL至8 mL和65 mL至4 mL。对于这些,我们分别将45 mL和65 mL加载到4 mL柱上,对于中心点和最坏情况。

在每个步骤阶段(流动、清洗等),从每次运行中收集样品。我们立即用50%组织培养感染剂量(TCID)分析病毒样本50)检测或定量实时聚合酶链反应(qPCR)。MVM-MVP样本在免疫定量PCR分析(如下所述)之前储存在–80°C下。根据这些结果,我们使用标准计算确定了对数减少值(LRV)(5.)。

在本研究中,我们进行了亲和捕获实验,以探测潜在的非特异性结合相互作用(表1)。然后用中心点条件纯化亲和,比较病毒清除情况。此外,我们通过使用不含功能化V的POROS基基质进行AAV8中心点运行,评估病毒和碱基珠之间的相互作用HH配体;我们评估了病毒-VH使用POROS树脂与替代V的H-配体相互作用HH配体特异性对不能结合AAV的MAB的FC部分。

我们采用正交试验方法——表面等离子体共振(SPR)——来确认AAVX配体对AAV的特异性。为此,生物素化AAVX VH将H配体固定在检测表面上,使得可以通过注射游离MVM-MVP或AAV来产生结合敏感图。

图1: (a) 免疫定量实时聚合酶链反应;(b) 免疫-qPCR标准曲线

分析化验和LRV测定:Texcell的科学家使用经验证的斑块形成传染性试验对XMuLV的传染性滴度进行了量化。他们使用经验证的TCID50感染性分析对HAV、Reo-3、HSV-1和MVM进行量化。PRV通过经验证的qPCR分析进行定量。根据这些滴度测定,我们采用标准方法计算LRV(5.)。

为了分析每个样本中非感染性MVM-MVP的浓度,Cygnus Technologies的科学家进行了免疫qPCR分析(图1a),如其他地方所述(8.)。简而言之,将样品加入涂有抗MVM-MVP捕获MAb的微孔中。孵育和洗涤后,加入DNA缀合的抗MVM-MVP检测器MAB。在再次孵育和洗涤步骤之后,将解离缓冲液加入每个孔中5分钟。然后将5μl样品从每个孔中转移到含有针对共轭DNA的Taqman引物/探针(Thermo Fisher Scientific)的QPCR板。为了确定未知样品中的颗粒量,阈值循环(CT)值被插入通过包括10倍稀释系列的已知MVM-MVP标准(图1B)产生的标准曲线。从那些浓度值,我们可以计算每个实验的MVM-MVP LRV。

结果和讨论
AAV下游过程的病毒清除策略受限于在不同时灭活或去除AAV产物的情况下执行病毒灭活和过滤步骤的困难。因此,色谱分离模式对于达到所需的病毒去除水平至关重要。

使问题进一步复杂化的是,MVM(一种国际上用作模型加标剂的小型非包膜病毒)与AAV属于同一细小病毒家族。形态和物理化学性质(大小、表面电荷和表面疏水性)在两种病毒中相似。由于这些物理化学相似性,通过亲和作用或离子相互作用结合和洗脱AAV的优化步骤也可能结合MVM。这将导致此类病毒污染物的去除效果不佳-或者相反,当产品清洗或清洗时,去除MVM的优化步骤可能会影响AAV产量与MVM一起洗脱。

考虑到这一点,在我们的研究中,我们想阐明是否可以通过POROS CaptureSelect AAV柱和CIMmultus QA整体柱的组合从AAV中分离病毒(包括MVM),从而提供有效的病毒清除。

关联捕获:图2总结了使用POROS CaptureSelect AAVX亲和树脂进行的所有病毒清除率峰值试验的结果。在制造中心点工艺条件下,病毒的有效清除率≥4 LRV被证明适用于XMuLV、MVM、HAV和PRV。AAVX树脂也有助于清除这些病毒≥2.5 Reo-3和HSV-1的LRV。在最坏情况下-条件试验期间,观察到所有受试模型病毒的清除水平相似。综上所述,使用POROS CaptureSelect AAVX亲和色谱法显示的强大病毒清除与AAVX树脂之间亲和作用的高度特异性一致和AAV载体。其高度的特异性和能力由camelid V介导H将H抗体配体功能化为定制设计的基珠,其组合提供与AAV载体的高亲和力结合,同时最小化非特异性相互作用。

图2:使用亲和树脂的病毒间隙;有关完整病毒名称,请参阅表1

在测试的六种模型病毒中,MVM在大小上与AAV相似,并且具有很高的抗失活能力,因此可能存在去除MVM的问题。属于同一病毒的一个成员的未经修饰的DNA病毒Parvoviridae.作为AAV家族,MVM具有相似的衣壳结构,因此可能具有相似的病毒形态和物理化学性质(大小、表面电荷、表面疏水性)。

表2详细说明了我们对MVM和MVM-MVP(Cygnus Technologies作为生物安全1级安全分析工具创建的非感染性MVM替代物)的结果。对于中心点运行和最坏情况运行,最初加载到柱上的大多数MVM都包含在流通部分中(分别为66.1%和55.0%)。同样,大多数MVM MVP也出现在流通部分(中心点运行和最坏情况运行分别为52.6–67.0%和79.1%)。亲和洗涤步骤对MVM柱的进一步剥离几乎没有影响(中心点为0.2%);中等数量的MVM MVP被移除(中心点和最坏情况下分别为10.4%和14.3%)。在收集的洗脱组分中发现少量MVM和MVM MVP。

图3: 添加小鼠微小病毒(MVM)和非感染性MVM模拟病毒颗粒(MVM MVP)的亲和树脂运行的对数减少值(LRV)测定

从MVM中心点和最坏情况运行,3.8日志10.和4.3日志10.在洗脱过程中分别检测到总颗粒,导致LRV计算为4.35±0.38和3.58±0.46(图3)。LRV的差异可能归因于工艺参数(负载率和停留时间)对病毒-配体相互作用的影响。正如预测的那样,较高的负载比和停留时间产生的对数接近1.010.MVM清除率降低。对于MVM-MVP中心点和最差情况运行,7.0-7.4和7.8日志10.分别测定了总颗粒,给出了4.91–5.16和4.07的LRV计算结果。因此,在每种条件下,两种颗粒类型的清除结果相似,可以通过使用MVM-MVP监测MVM的清除率降低趋势。图3还显示了使用alter的中心点运行的LRV结果本机基地矩阵。

总的来说,这些结果证明了POROS CaptureSelect AAVX亲和树脂的高选择性,它可以区分AAV的表面表位和进化上相似的病毒MVM。如此高的特异性使树脂能够将这两种颗粒类型从含有这两种颗粒的非均质混合物中分离出来。我们的数据还揭示了MVM和MVM-MVP之间的可比结果,证明了MVM-MVP作为过程开发和表征的尖峰/分析工具的实用性。

图4:基于日志减少值(LRV)的非特异性相互作用的表征,用于异晶鼠白血病病毒(Xmulv)和小鼠的微小病毒(MVM)

为了探索非特异性结合,使用MVM和XMuLV进行了更详细的相互作用研究,这两种病毒是病毒清除峰值研究中最常用的模型病毒(9.)。为了探测病毒-AAV相互作用,我们执行了AAV-NULL运行,其中尖刺病毒负荷没有AAV8产品。如图4所示,NULL运行对MVM和XMULV的制造控制运行表现出类似的性能,表明AAV8的存在对模型病毒的间隙具有最小的影响。

接下来,探测病毒和v之间的相互作用H我们使用了两种由Thermo Fisher Scientific设计的对照树脂,即H配体或POROS基珠。第一种对照树脂是AAVX类树脂,具有相同的基珠,但功能化的VHH配体具有另一种特异性,不能结合AAV。第二个对照是不含功能化V的POROS CaptureSelect AAVX树脂HH配体。使用这些对照树脂,我们观察到与使用未修饰的POROS CaptureSelect AAVX亲和树脂的中心点运行的病毒清除水平相似,这表明病毒与配体或碱珠之间的相互作用极小。这些结果强烈表明,模型病毒没有表现出对任何V的非特异性结合HH配体或与POROS碱基珠结合,并且这些病毒与AAV产物之间的相互作用最小。

图5: camelid V的结合选择性H表面等离子体共振(SPR)分析H抗体片段亲和配体

SPR结果表明AAVX vHH配体与注入的AAV1绑定,但不是MVM-MVP(图5)。对于实验控制,当将AAV掺入0.1μg/ mL MVM-MVP背景时,回收结合信号。这些数据表明病毒颗粒(感染或其他)的存在不会干扰AAV与特定AAVX v的能力HH配体。

整块抛光:表3-9显示了来自我们CIMMULTUS QA Spiking实验的完整病毒清除结果(包括MVM-MVP)。在每个实验期间,我们捕获了流过,三个预先预先洗脱峰,两个后峰峰和带材分数以及负载和主AAV洗脱池。作为数据展示,除了用于中心点或最坏情况条件的条带之外的任何分数中没有检测到病毒(或MVM-MVP)。这表明在该下游AAV过程步骤中的所有病毒类型的完全清除。病毒在流过,主峰和后峰系上也无法检测到。

条带馏分内的病毒滴度显着,但病毒不同。在条带分数中检测到的MVM量大于整体挑战,这可能表明对测定的干扰。在某些情况下,收集的级分中检测到的总病毒的质量平衡并不等于攻击的病毒量。可归因于汽提剂和/或使用汽提剂的剥离剂的(部分)降解过量时间以洗脱所有病毒的时间。

图6:Monolith对数约简值(lrv);有关完整病毒名称,请参阅表1

图6显示了每个实验的LRV。整料雄性为各种物理化学上不同的病毒提供了有效的去除。此外,LRV数据在中央点和最坏情况条件下表明MVM和MVM-MVP间隙之间的可比性。

最终结果:表10列出了在中心点制造条件下使用POROS CaptureSelect AAVX亲和树脂和CIMmultus QA整体抛光步骤后获得的整个过程LRV。

一个准确的经济预测模型
我们试图通过AAV净化过程中的色谱方法确定是否可以实现有效的病毒清除。通过使用广泛和包容性病毒的尖峰研究,我们确定了分离的色谱模式确实可以提供有效的病毒清除策略。Poros捕获AAVX亲和树脂和CIMMULTUSQA阴离子 - 交换整料均表现出降低病毒水平并有助于高整体过程LRV的能力。

在这项研究中,我们还试图确定是否生物安全级别1,非传染性模拟MVM粒子可以作为预测MVM去除的准确替代品。本研究获得的MVM和MVM- mvp结果之间的高度相关性表明,该方法可以为预测其他AAV色谱分离技术的病毒清除效果提供一个准确、经济的模型。

参考
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通讯作者迈克尔·温克勒mwinkler@regenxbio.com)是下游工艺开发和验证的主管,米哈伊尔·戈德法布*他是校长工艺开发科学家,Shaojie翁他是一名科学家,杰夫史密斯是一名高级副科学家苏珊韦西布拉特是Regenxbio Inc.的CMC技术作家,9600 Blackwell Road,Suite 210,Rockville,MD 20850。李约翰他是一名全职科学家,亚历杭德罗·贝塞拉是首席应用科学家,并且桑德拉·贝泽默凯文·斯莱彭他们是马萨诸塞州贝德福德威金斯大道35号赛默飞世尔科学公司的科学家,邮编01730。AlešŠtrancar.是首席执行官,莎拉·普里梅克是销售和产品经理,以及罗米娜·扎巴尔是斯洛文尼亚SI-5270 Ajdovščchina Mirce 21 BIA分离部的质量保证负责人。四月舒伯特是北美业务发展总监,并且阿库纳·伊海纳乔是位于马里兰州弗雷德里克市新设计路4991号Texcell的科学总监,邮编21703。大卫·塞特林他是Cygnus Technologies LLC (4332 Southport- supply Road SE, NC 28461)的研发高级总监。

*Goldfarb现在是Arcellx,Inc.蛋白质纯化主管。

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